مائوسين هيوي چين کان ٻاهر انساني کنڊ جي عضلاتي فائبرن جي هيٽروجينيٽي

nature.com تي وڃڻ لاءِ مهرباني. توهان جيڪو برائوزر ورجن استعمال ڪري رهيا آهيو ان ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان تجويز ڪريون ٿا ته جديد برائوزر ورجن استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). اضافي طور تي، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، هي سائيٽ اسٽائلز ۽ جاوا اسڪرپٽ کان پاڪ هوندي.
اسڪيلٽل عضلات هڪ غير متجانس ٽشو آهي جيڪو گهڻو ڪري مائو فائبرلز تي مشتمل آهي، جيڪو انسانن ۾ عام طور تي ٽن قسمن ۾ ورهايل آهي: هڪ "سست" (قسم 1) ۽ ٻه "تيز" (قسم 2A ۽ 2X). بهرحال، روايتي مائو فائبريل قسمن جي وچ ۾ ۽ اندر هيٽروجينيٽي خراب سمجهي وئي آهي. اسان انساني ويسٽس ليٽرالس مان ترتيب وار 1050 ۽ 1038 انفرادي مائو فائبرلز تي ٽرانسڪرپٽومڪ ۽ پروٽومڪ طريقا لاڳو ڪيا. پروٽومڪ مطالعي ۾ مرد شامل هئا، ۽ ٽرانسڪرپٽومڪ مطالعي ۾ 10 مرد ۽ 2 عورتون شامل هيون. مائوسين هيوي چين آئسفارمز کان علاوه، اسان ميٽابولڪ پروٽين، رائبوسومل پروٽين، ۽ سيلولر جنڪشنل پروٽين کي ملٽي ڊائمينشنل انٽرميوفبريل متغير جي ذريعن جي طور تي سڃاڻپ ڪيو. ان کان علاوه، سست ۽ تيز فائبرن جي ڪلسٽرن جي سڃاڻپ جي باوجود، اسان جو ڊيٽا مشورو ڏئي ٿو ته ٽائپ 2X فائبر ٻين تيز-ٽوچ فائبرن کان فينوٽائپ طور تي الڳ نه ٿي سگهن ٿا. وڌيڪ، مائوسين هيوي چين تي ٻڌل درجه بندي نيمالائن ميوپيٿيز ۾ مائوفائبر فينوٽائپ کي بيان ڪرڻ لاءِ ڪافي ناهي. مجموعي طور تي، اسان جو ڊيٽا ملٽي ڊائمينشنل مائوفائبر هيٽروجينيٽي جو مشورو ڏئي ٿو، جنهن ۾ تبديلي جا ذريعا مائوسين هيوي چين آئسفارمز کان ٻاهر وڌندا آهن.
سيلولر هيٽروجنيٽي سڀني حياتياتي نظامن جي هڪ موروثي خاصيت آهي، جيڪا سيلز کي ٽشوز ۽ سيلز جي مختلف ضرورتن کي پورو ڪرڻ لاءِ ماهر ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي. 1 اسڪيلٽ عضلاتي فائبر هيٽروجنيٽي جو روايتي نظريو اهو رهيو آهي ته موٽر نيورون موٽر يونٽ اندر فائبر جي قسم کي بيان ڪن ٿا، ۽ اهو فائبر جو قسم (يعني، انسانن ۾ قسم 1، قسم 2A، ۽ قسم 2X) مائوسين هيوي چين (MYH) آئسفارمز جي خاصيتن جي ذريعي طئي ڪيو ويندو آهي. 2 اهو شروعاتي طور تي انهن جي pH ATPase عدم استحڪام تي ٻڌل هو، 3,4 ۽ بعد ۾ MYH جي انهن جي ماليڪيولر اظهار تي. 5 بهرحال، "مخلوط" فائبرن جي سڃاڻپ ۽ بعد ۾ قبوليت سان جيڪي مختلف تناسب ۾ ڪيترن ئي MYHs کي گڏ ڪري ظاهر ڪن ٿا، اسڪيلٽ عضلاتي فائبرن کي مختلف فائبر قسمن جي بدران هڪ تسلسل جي طور تي ڏٺو وڃي ٿو. 6 ان جي باوجود، فيلڊ اڃا تائين مائو فائبر جي درجه بندي لاءِ بنيادي درجه بندي ڪندڙ جي طور تي MYH تي تمام گهڻو انحصار ڪري ٿو، هڪ نظريو ممڪن طور تي ابتدائي ڪُرڙي جي مطالعي جي حدن ۽ اهم تعصبن کان متاثر ٿئي ٿو جن جي MYH اظهار پروفائلز ۽ فائبر جي قسمن جي حد انسانن ۾ انهن کان مختلف آهي. 2 صورتحال ان حقيقت جي ڪري وڌيڪ پيچيده آهي ته مختلف انساني اسڪيلٽ عضلات نمائش ڪن ٿا. فائبر جي قسمن جي هڪ متنوع رينج. 7 ويسٽس ليٽرالس هڪ مخلوط عضلات آهي جنهن ۾ هڪ وچولي (۽ تنهن ڪري نمائندگي ڪندڙ) MYH اظهار پروفائل آهي. 7 ان کان علاوه، نموني جي آساني ان کي انسانن ۾ بهترين مطالعو ڪيل عضلات بڻائي ٿي.
تنهن ڪري، طاقتور "اومڪس" اوزارن جي استعمال سان اسڪيلٽل عضلاتي فائبر جي تنوع جي غير جانبدار تحقيق نازڪ آهي پر چئلينجنگ پڻ آهي، جزوي طور تي اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي ملٽي نيوڪليٽيڊ فطرت جي ڪري. بهرحال، ٽرانسڪرپٽوميڪس8,9 ۽ پروٽوميڪس10 ٽيڪنالاجيون تازن سالن ۾ حساسيت ۾ هڪ انقلاب مان گذريون آهن مختلف ٽيڪنالاجي ترقي جي ڪري، سنگل فائبر ريزوليوشن تي اسڪيلٽل عضلات جي تجزيي جي اجازت ڏئي ٿي. نتيجي طور، سنگل فائبر جي تنوع ۽ ايٽروفڪ محرکات ۽ عمر جي 11,12,13,14,15,16,17,18 جي ​​جواب ۾ اهم ترقي ڪئي وئي آهي. اهم طور تي، انهن ٽيڪنالاجي ترقي ۾ ڪلينڪل ايپليڪيشنون آهن، جيڪي بيماري سان لاڳاپيل ڊيس ريگيوليشن جي وڌيڪ تفصيلي ۽ صحيح خاصيت جي اجازت ڏين ٿيون. مثال طور، نيملين ميوپيٿي جي پيٿوفزيولوجي، سڀ کان عام وراثت ۾ مليل عضلاتي بيمارين مان هڪ (MIM 605355 ۽ MIM 161800)، پيچيده ۽ مونجهارو آهي.19,20 تنهن ڪري، اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي ڊيس ريگيوليشن جي بهتر خاصيت هن بيماري جي اسان جي سمجھ ۾ اهم ترقي جو سبب بڻجي سگهي ٿي.
اسان انساني بايوپسي نمونن کان دستي طور تي الڳ ٿيل سنگل اسڪيلٽ عضلاتي فائبرن جي ٽرانسڪرپٽوميڪ ۽ پروٽوميڪ تجزيي لاءِ طريقا تيار ڪيا ۽ انهن کي هزارين فائبرن تي لاڳو ڪيو، جنهن سان اسان کي انساني اسڪيلٽ عضلاتي فائبرن جي سيلولر هيٽروجينيٽي جي جاچ ڪرڻ جي اجازت ملي. هن ڪم جي دوران، اسان عضلاتي فائبرن جي ٽرانسڪرپٽوميڪ ۽ پروٽوميڪ فينوٽائپنگ جي طاقت جو مظاهرو ڪيو ۽ ميٽابولڪ، رائبوسومل، ۽ سيلولر جنڪشنل پروٽين کي انٽرفائبر متغير جي اهم ذريعن جي طور تي سڃاڻپ ڪيو. وڌيڪ، هن پروٽوميڪ ورڪ فلو کي استعمال ڪندي، اسان سنگل اسڪيلٽ عضلاتي فائبرن ۾ نيميٽوڊ ميوپيٿي جي ڪلينڪل مطابقت کي بيان ڪيو، MYH جي بنياد تي فائبر جي قسم کان آزاد غير آڪسائيڊيوٽ فائبرن ڏانهن هڪ هم آهنگ شفٽ کي ظاهر ڪيو.
انساني اسڪيليٽل عضلاتي فائبرن جي هيٽروجينيٽي جي جاچ ڪرڻ لاءِ، اسان سنگل اسڪيليٽل عضلاتي فائبرن جي ٽرانسڪرپٽوم ۽ پروٽوم تجزيي کي فعال ڪرڻ لاءِ ٻه ورڪ فلو تيار ڪيا (شڪل 1A ۽ ضمني شڪل 1A). اسان آر اين اي ۽ پروٽين جي سالميت جي نموني اسٽوريج ۽ تحفظ کان وٺي هر طريقي لاءِ ٿرو پُٽ کي بهتر ڪرڻ تائين ڪيترائي طريقائي قدم تيار ڪيا ۽ بهتر ڪيا. ٽرانسڪرپٽوم تجزيي لاءِ، اهو ريورس ٽرانسڪرپشن جي شروعاتي مرحلي تي نموني جي مخصوص ماليڪيولر بارڪوڊ داخل ڪندي حاصل ڪيو ويو، جنهن سان 96 فائبرن کي موثر ڊائون اسٽريم پروسيسنگ لاءِ گڏ ڪيو ويو. روايتي سنگل سيل طريقن جي مقابلي ۾ وڌيڪ گہرے ترتيب (±1 ملين ريڊ في فائبر) ٽرانسڪرپٽوم ڊيٽا کي وڌيڪ مالا مال ڪيو. 21 پروٽومڪس لاءِ، اسان هڪ مختصر ڪروميٽوگرافڪ گريڊينٽ (21 منٽ) استعمال ڪيو جيڪو TimsTOF ماس اسپيڪٽروميٽر تي DIA-PASEF ڊيٽا حاصل ڪرڻ سان گڏ هڪ ٽائمسٽو ايف ماس اسپيڪٽروميٽر تي پروٽوم جي کوٽائي کي بهتر ڪرڻ لاءِ جڏهن ته اعليٰ ٿرو پُٽ کي برقرار رکڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. 22,23 صحتمند کنڊ جي عضلاتي فائبرن جي هيٽروجينيٽي جي جاچ ڪرڻ لاءِ، اسان 14 صحتمند بالغ ڊونرز مان 1,050 انفرادي فائبرن جي ٽرانسڪرپٽومز ۽ 5 صحتمند بالغ ڊونرز مان 1,038 فائبرن جي پروٽوم جي خاصيت ڪئي (ضمني جدول 1). هن پيپر ۾، انهن ڊيٽاسيٽس کي ترتيب وار 1,000-فائبر ٽرانسڪرپٽومز ۽ پروٽوم جي طور تي حوالو ڏنو ويو آهي. اسان جي طريقي 1,000-فائبر ٽرانسڪرپٽومز ۽ پروٽوم تجزين ۾ ڪل 27,237 ٽرانسڪرپٽومز ۽ 2,983 پروٽين کي ڳولي لڌو (شڪل 1A، ضمني ڊيٽاسيٽس 1-2). 1,000 کان وڌيڪ دريافت ڪيل جينز ۽ في فائبر 50٪ صحيح قدرن لاءِ ٽرانسڪرپٽومز ۽ پروٽوم ڊيٽاسيٽس کي فلٽر ڪرڻ کان پوءِ، بعد ۾ بايو انفارميٽڪس تجزيا ٽرانسڪرپٽومز ۽ پروٽوم ۾ 925 ۽ 974 فائبرن لاءِ ترتيب وار ڪيا ويا. فلٽر ڪرڻ کان پوءِ، في فائبر سراسري طور تي 4257 ± 1557 جينز ۽ 2015 ± 234 پروٽين (مطلب ± SD) ڳوليا ويا، محدود بين-انفرادي متغير سان (ضمني انگ اکر 1B-C، ضمني ڊيٽا سيٽ 3-4). جڏهن ته، شرڪت ڪندڙن ۾ موضوع جي اندر متغير وڌيڪ واضح هو، ممڪن طور تي مختلف ڊيگهه ۽ ڪراس-سيڪشنل علائقن جي فائبرن جي وچ ۾ آر اين اي/پروٽين جي پيداوار ۾ فرق جي ڪري. گھڻن پروٽينن (>2000) لاءِ، تغير جو ڪوفيشيٽ 20٪ کان گهٽ هو (ضمني انگ اکر 1D). ٻنهي طريقن سان ٽرانسڪرپٽس ۽ پروٽين جي وسيع متحرڪ رينج کي قبضو ڪرڻ جي اجازت ڏني وئي جيڪي عضلات جي ڇڪتاڻ لاءِ اهم آهن (مثال طور، ACTA1، MYH2، MYH7، TNNT1، TNNT3) (ضمني انگ اکر 1E-F). گهڻيون سڃاڻپ ڪيل خاصيتون ٽرانسڪرپٽومڪ ۽ پروٽومڪ ڊيٽاسيٽس جي وچ ۾ عام هيون (ضمني شڪل 1G)، ۽ انهن خاصيتن جي سراسري UMI/LFQ شدت مناسب طور تي سٺي نموني سان لاڳاپيل هئي (r = 0.52) (ضمني شڪل 1H).
ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ پروٽوميڪس ورڪ فلو (BioRender.com سان ٺهيل). MYH7، MYH2، ۽ MYH1 لاءِ BD متحرڪ رينج وکر، ۽ فائبر قسم جي اسائنمنٽ لاءِ حساب ڪيل حدون. E، F ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ پروٽوميڪس ڊيٽاسيٽس ۾ فائبرن ۾ MYH اظهار جي ورڇ. G، H يونيفارم ڊائيورسٽٽي اپروڪسيميشن ۽ پروجيڪشن (UMAP) پلاٽ ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ پروٽوميڪس لاءِ MYH-بنياد فائبر قسم پاران رنگين. I، J فيچر پلاٽ ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ پروٽوميڪس ڊيٽاسيٽس ۾ MYH7، MYH2، ۽ MYH1 اظهار ڏيکاري رهيا آهن.
اسان شروعات ۾ هر فائبر کي MYH تي ٻڌل فائبر قسم تفويض ڪرڻ جو ارادو ڪيو جيڪو هڪ بهتر طريقو استعمال ڪندي آهي جيڪو Omics ڊيٽاسيٽس ۾ MYH اظهار جي اعلي حساسيت ۽ متحرڪ حد جو فائدو وٺندو آهي. پوئين مطالعي ۾ فائبرن کي خالص قسم 1، قسم 2A، قسم 2X، يا مختلف MYHs11،14،24 جي اظهار جي هڪ مقرر سيڪڙو جي بنياد تي مخلوط طور تي ليبل ڪرڻ لاءِ من ماني حد استعمال ڪئي وئي آهي. اسان هڪ مختلف طريقو استعمال ڪيو جنهن ۾ هر فائبر جي اظهار کي MYHs پاران درجه بندي ڪئي وئي هئي جيڪي اسان فائبرن کي ٽائيپ ڪرڻ لاءِ استعمال ڪندا هئاسين: MYH7، MYH2، ۽ MYH1، ترتيب وار قسم 1، قسم 2A، ۽ قسم 2X فائبرن سان ملندڙ جلندڙ. پوءِ اسان رياضي طور تي هر نتيجي واري وکر جي هيٺين انفلڪشن پوائنٽ جو حساب ڪيو ۽ ان کي هر MYH لاءِ مثبت (حد کان مٿي) يا منفي (حد کان هيٺ) طور فائبرن کي تفويض ڪرڻ لاءِ حد طور استعمال ڪيو (شڪل 1B-D). اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته MYH7 (شڪل 1B) ۽ MYH2 (شڪل 1C) ۾ پروٽين جي سطح جي مقابلي ۾ RNA سطح تي وڌيڪ واضح آن/آف ايڪسپريشن پروفائل آهن. حقيقت ۾، پروٽين جي سطح تي، تمام گهٽ فائبر MYH7 کي ظاهر نه ڪندا هئا، ۽ ڪنهن به فائبر ۾ 100٪ MYH2 ايڪسپريشن نه هوندو هو. اسان اڳتي هلي هر ڊيٽاسيٽ ۾ سڀني فائبرن کي MYH-بنياد فائبر قسمن کي تفويض ڪرڻ لاءِ اڳواٽ مقرر ڪيل ايڪسپريشن حدون استعمال ڪيون. مثال طور، MYH7+/MYH2-/MYH1- فائبرن کي قسم 1 تي تفويض ڪيو ويو، جڏهن ته MYH7-/MYH2+/MYH1+ فائبرن کي مخلوط قسم 2A/2X تي تفويض ڪيو ويو (مڪمل وضاحت لاءِ ضمني جدول 2 ڏسو). سڀني فائبرن کي گڏ ڪندي، اسان RNA (شڪل 1E) ۽ پروٽين (شڪل 1F) سطحن تي MYH-بنياد فائبر قسمن جي هڪ قابل ذڪر ساڳي ورڇ ڏٺي، جڏهن ته MYH-بنياد فائبر قسمن جي نسبتي جوڙجڪ فردن ۾ مختلف هئي، جيئن توقع ڪئي وئي (ضمني شڪل 2A). گھڻن فائبرن کي يا ته خالص قسم 1 (34-35٪) يا قسم 2A (36-38٪) جي طور تي درجه بندي ڪيو ويو، جيتوڻيڪ مخلوط قسم 2A/2X فائبرن جو هڪ اهم تعداد پڻ دريافت ڪيو ويو (16-19٪). هڪ حيرت انگيز فرق اهو آهي ته خالص قسم 2X فائبر صرف آر اين اي سطح تي ڳولي سگهجن ٿا، پر پروٽين جي سطح تي نه، اهو مشورو ڏئي ٿو ته تيز MYH اظهار گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور تي پوسٽ ٽرانسڪرپشن طور تي منظم ڪيو ويندو آهي.
اسان اينٽي باڊي تي ٻڌل ڊاٽ بلوٽنگ استعمال ڪندي پنهنجي پروٽومڪس تي ٻڌل MYH فائبر ٽائپنگ طريقي جي تصديق ڪئي، ۽ ٻنهي طريقن خالص قسم 1 ۽ قسم 2A فائبر جي سڃاڻپ ۾ 100٪ اتفاق حاصل ڪيو (ضمني شڪل 2B ڏسو). جڏهن ته، پروٽومڪس تي ٻڌل طريقو وڌيڪ حساس، مخلوط فائبر جي سڃاڻپ ۾ وڌيڪ ڪارآمد، ۽ هر فائبر ۾ هر MYH جين جي تناسب کي مقدار ڏيڻ ۾ وڌيڪ ڪارآمد هو. اهي ڊيٽا اسڪيلٽل عضلاتي فائبر جي قسمن کي بيان ڪرڻ لاءِ هڪ مقصدي، انتهائي حساس اومڪس تي ٻڌل طريقو استعمال ڪرڻ جي اثرائتي کي ظاهر ڪن ٿا.
پوءِ اسان ٽرانسڪرپٽوميڪس ۽ پروٽوميڪس پاران مهيا ڪيل گڏيل معلومات کي استعمال ڪيو ته جيئن مايو فائبرز کي انهن جي مڪمل ٽرانسڪرپٽومي يا پروٽومي جي بنياد تي معروضي طور تي درجه بندي ڪري سگهجي. ڇهن مکيه حصن تائين طول و عرض کي گهٽائڻ لاءِ يونيفارم ميني فولڊ اپروڪسميشن ۽ پروجئشن (UMAP) طريقو استعمال ڪندي، اسان ٽرانسڪرپٽومي (شڪل 1G) ۽ پروٽومي (شڪل 1H) ۾ مايو فائبر متغير کي ڏسڻ جي قابل هئاسين. خاص طور تي، مائي فائبرز کي شرڪت ڪندڙن (ضمني شڪل 3C-D) يا ٽيسٽنگ ڏينهن (ضمني شڪل 3E) پاران ٽرانسڪرپٽوميڪس يا پروٽوميڪس ڊيٽاسيٽس ۾ گروپ نه ڪيو ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اسڪيلٽل عضلاتي فائبرز ۾ موضوع جي اندر متغيريت موضوع جي وچ ۾ متغيريت کان وڌيڪ آهي. UMAP پلاٽ ۾، ٻه الڳ ڪلسٽر "تيز" ۽ "سست" مائي فائبرز جي نمائندگي ڪن ٿا (شڪل 1G-H). MYH7+ (سست) مائوفائبرز UMAP1 جي مثبت قطب تي ڪلستر ڪيا ويا، جڏهن ته MYH2+ ۽ MYH1+ (تيز) مائوفائبرز UMAP1 جي منفي قطب تي ڪلستر ڪيا ويا (شڪلون 1I-J). بهرحال، MYH اظهار جي بنياد تي فاسٽ ٽوئچ فائبر جي قسمن (يعني، قسم 2A، قسم 2X، يا مخلوط 2A/2X) جي وچ ۾ ڪو به فرق نه ڪيو ويو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته MYH1 (شڪل 1I-J) يا ٻيا ڪلاسيڪل 2X مائوفائبر مارڪر جهڙوڪ ACTN3 يا MYLK2 (ضمني شڪلون 4A-B) اظهار مختلف مائوفائبر قسمن جي وچ ۾ فرق نٿو ڪري جڏهن پوري ٽرانسڪرپٽوم يا پروٽوم تي غور ڪيو وڃي. ان کان علاوه، MYH2 ۽ MYH7 جي مقابلي ۾، ڪجھ ٽرانسڪرپٽ يا پروٽين مثبت طور تي MYH1 سان لاڳاپيل هئا (اضافي شڪلون 4C-H)، اهو مشورو ڏئي ٿو ته MYH1 جي گهڻائي مائوفائبر ٽرانسڪرپٽوم/پروٽوم کي مڪمل طور تي ظاهر نه ڪندي آهي. UMAP سطح تي ٽن MYH آئسفارمز جي مخلوط اظهار جو جائزو وٺڻ وقت ساڳيا نتيجا نڪتا (ضمني شڪلون 4I-J). اهڙيءَ طرح، جڏهن ته 2X فائبر صرف MYH مقدار جي بنياد تي ٽرانسڪرپٽ سطح تي سڃاڻپ ڪري سگهجن ٿا، MYH1+ فائبر ٻين تيز فائبرن کان الڳ نه آهن جڏهن پوري ٽرانسڪرپٽوم يا پروٽوم تي غور ڪيو وڃي.
MYH کان ٻاهر سست فائبر هيٽروجينيٽي جي شروعاتي ڳولا جي طور تي، اسان چار قائم ڪيل سست فائبر قسم جي مخصوص پروٽين جو جائزو ورتو: TPM3، TNNT1، MYL3، ۽ ATP2A22. سست فائبر ذيلي قسمن ٽرانسڪرپٽوميڪس (ضمني شڪل 5A) ۽ پروٽوميڪس (ضمني شڪل 5B) ٻنهي ۾ MYH7 سان پيئرسن جي اعلي، جيتوڻيڪ مڪمل نه، لاڳاپن کي ڏيکاريو. تقريبن 25٪ ۽ 33٪ سست فائبرن کي ٽرانسڪرپٽوميڪس (ضمني شڪل 5C) ۽ پروٽوميڪس (ضمني شڪل 5D) ۾ سڀني جين/پروٽين ذيلي قسمن پاران خالص سست فائبر جي طور تي درجه بندي نه ڪئي وئي هئي. تنهن ڪري، ڪيترن ئي جين/پروٽين ذيلي قسمن جي بنياد تي سست فائبر جي درجه بندي اضافي پيچيدگي متعارف ڪرائي ٿي، جيتوڻيڪ پروٽين لاءِ جيڪي فائبر قسم جي مخصوص آهن. اهو مشورو ڏئي ٿو ته هڪ واحد جين/پروٽين خاندان جي آئسفارمز تي ٻڌل فائبر جي درجه بندي شايد کنڊ جي عضلاتي فائبرن جي حقيقي هيٽروجينيٽي کي مناسب طور تي ظاهر نه ڪري سگهي.
پوري اومڪس ماڊل جي پيماني تي انساني اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي فينوٽائپڪ متغير کي وڌيڪ ڳولڻ لاءِ، اسان پرنسپل جزو تجزيو (PCA) استعمال ڪندي ڊيٽا جي غير جانبدار طول و عرض ۾ گهٽتائي ڪئي (شڪل 2A). UMAP پلاٽن وانگر، نه ته شرڪت ڪندڙ ۽ نه ئي ٽيسٽنگ ڏينهن PCA سطح تي فائبر ڪلسٽرنگ کي متاثر ڪيو (ضمني انگ اکر 6A-C). ٻنهي ڊيٽاسيٽس ۾، MYH تي ٻڌل فائبر قسم PC2 پاران وضاحت ڪئي وئي هئي، جنهن سست-ٽوچ قسم 1 فائبرن جو هڪ ڪلسٽر ۽ هڪ ٻيو ڪلسٽر ڏيکاريو جنهن ۾ فاسٽ-ٽوچ قسم 2A، قسم 2X، ۽ مخلوط 2A/2X فائبر شامل هئا (شڪل 2A). ٻنهي ڊيٽاسيٽس ۾، اهي ٻئي ڪلسٽر ٿوري تعداد ۾ مخلوط قسم 1/2A فائبرن سان ڳنڍيل هئا. جيئن توقع ڪئي وئي، مکيه پي سي ڊرائيورن جي اوور ريپريزنٽيشن تجزيي تصديق ڪئي ته PC2 ڪانٽريڪٽائل ۽ ميٽابولڪ دستخطن (شڪل 2B ۽ ضمني انگ اکر 6D-E، ضمني ڊيٽاسيٽس 5-6) ذريعي هلائي وئي هئي. مجموعي طور تي، MYH تي ٻڌل فائبر قسم PC2 سان مسلسل تبديلي جي وضاحت ڪرڻ لاءِ ڪافي مليو، نام نهاد 2X فائبرن جي استثنا سان جيڪي فاسٽ ڪلسٽر اندر ٽرانسڪرپٽوم ۾ ورهايل هئا.
الف. ٽرانسڪرپٽوم ۽ پروٽوم ڊيٽاسيٽس جا پرنسپل جزو تجزيو (PCA) پلاٽ MYH جي بنياد تي فائبر جي قسم مطابق رنگ ڪيا ويا. ب. PC2 ۽ PC1 ۾ ٽرانسڪرپٽ ۽ پروٽين ڊرائيورن جو افزودگي تجزيو. شمارياتي تجزيو ڪلسٽر پروفيلر پيڪيج ۽ بينجمني-هوچبرگ ترتيب ڏنل پي-ويليوز استعمال ڪندي ڪيو ويو. سي، ڊي. پروٽوم ۾ ٽرانسڪرپٽوم ۽ ڪاسٽامير GO اصطلاحن ۾ انٽرسيلولر ايڊهيشن جين آنٽولوجي (GO) اصطلاحن مطابق رنگ ڪيل پي سي اي پلاٽ. تير ٽرانسڪرپٽ ۽ پروٽين ڊرائيورن ۽ انهن جي هدايتن جي نمائندگي ڪن ٿا. اي، ايف. يونيفارم ميني فولڊ تقريبن ۽ پروجئشن (UMAP) ڪلينڪ طور تي لاڳاپيل خاصيتن جا پلاٽ پيش ڪن ٿا جيڪي سست / تيز فائبر قسم کان آزاد اظهار گريڊينٽ ڏيکارين ٿا. جي، ايڇ. ٽرانسڪرپٽومز ۽ پروٽوم ۾ PC2 ۽ PC1 ڊرائيورن جي وچ ۾ لاڳاپا.
غير متوقع طور تي، MYH تي ٻڌل مائوفائبر قسم صرف ٻئي نمبر تي متغير (PC2) جي وضاحت ڪئي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته MYH تي ٻڌل مائوفائبر قسم (PC1) سان لاڳاپيل ٻيا حياتياتي عنصر اسڪيلٽ عضلاتي فائبر هيٽروجينيٽي کي منظم ڪرڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا. PC1 ۾ مٿين ڊرائيورن جي اوورپريزنٽيشن تجزيي مان ظاهر ٿيو ته PC1 ۾ متغير بنيادي طور تي ٽرانسڪرپٽوم ۾ سيل-سيل آسنجن ۽ رائبوسوم مواد، ۽ پروٽوم ۾ ڪاسٽيمير ۽ رائبوسومل پروٽين (شڪل 2B ۽ ضمني انگ اکر 6D-E، ضمني ڊيٽا سيٽ 7) ذريعي طئي ڪيو ويو. اسڪيلٽ عضلات ۾، ڪاسٽيمير Z-ڊسڪ کي سارڪوليما سان ڳنڍيندا آهن ۽ فورس ٽرانسميشن ۽ سگنلنگ ۾ شامل آهن. 25 اينوٽيڊ پي سي اي پلاٽ سيل-سيل آسنجن (ٽرانسڪرپٽوم، شڪل 2C) ۽ ڪاسٽيمير (پروٽوم، شڪل 2D) خاصيتن کي استعمال ڪندي PC1 ۾ هڪ مضبوط کاٻي شفٽ ظاهر ڪيو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اهي خاصيتون ڪجهه فائبرن ۾ افزوده آهن.
UMAP سطح تي مائو فائبر ڪلسٽرنگ جي وڌيڪ تفصيلي جانچ مان ظاهر ٿيو ته گهڻيون خاصيتون مائو فائبر ذيلي ڪلسٽر-مخصوص جي بدران مائو فائبر قسم-آزاد MYH-بنياد اظهار گريڊينٽ ڏيکاريون. هي تسلسل ڪيترن ئي جينز لاءِ ڏٺو ويو جيڪي پيٿولوجيڪل حالتن سان لاڳاپيل هئا (شڪل 2E)، جهڙوڪ CHCHD10 (نيورومسڪولر بيماري)، SLIT3 (عضلات جي ايٽروفي)، CTDNEP1 (عضلات جي بيماري). هي تسلسل پروٽيم ۾ پڻ ڏٺو ويو، جنهن ۾ نيورولوجيڪل خرابين سان لاڳاپيل پروٽين (UGDH)، انسولين سگنلنگ (PHIP)، ۽ ٽرانسڪرپشن (HIST1H2AB) (شڪل 2F) شامل آهن. مجموعي طور تي، اهي ڊيٽا مختلف مائو فائبرن ۾ فائبر قسم-آزاد سست/تيز ٽوچ هيٽروجينيٽي ۾ تسلسل کي ظاهر ڪن ٿا.
دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، PC2 ۾ ڊرائيور جينز سٺو ٽرانسڪرپٽومي-پروٽيوم لاڳاپو (r = 0.663) (شڪل 2G) ڏيکاريو، جيڪو مشورو ڏئي ٿو ته سست ۽ تيز-ٽويچ فائبر جا قسم، ۽ خاص طور تي اسڪيلٽل عضلاتي فائبر جي ڪانٽريڪٽائل ۽ ميٽابولڪ خاصيتون، ٽرانسڪرپشن طور تي منظم آهن. جڏهن ته، PC1 ۾ ڊرائيور جينز ڪو به ٽرانسڪرپٽومي-پروٽيوم لاڳاپو (r = -0.027) (شڪل 2H) نه ڏيکاريو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته سست/تيز-ٽويچ فائبر جي قسمن سان لاڳاپيل تبديليون وڏي پيماني تي پوسٽ ٽرانسڪرپشن طور تي منظم ڪيون وينديون آهن. ڇاڪاڻ ته PC1 ۾ تبديليون بنيادي طور تي رائبوسومل جين آنٽولوجي اصطلاحن ذريعي بيان ڪيون ويون هيون، ۽ اهو ڏنو ويو ته رائبوسومل سيل ۾ هڪ اهم ۽ خاص ڪردار ادا ڪن ٿا پروٽين جي ترجمي ۾ فعال طور تي حصو وٺڻ ۽ متاثر ڪندي، 31 اسان اڳتي هلي هن غير متوقع رائبوسومل هيٽروجنيٽي جي جاچ ڪرڻ لاءِ نڪتاسين.
اسان پهريون ڀيرو GOCC اصطلاح "سائٽوپلاسمڪ رائبوسوم" (شڪل 3A) ۾ پروٽين جي نسبتي ڪثرت جي مطابق پروٽومڪس پرنسپل جزو تجزيي پلاٽ کي رنگ ڏنو. جيتوڻيڪ هي اصطلاح PC1 جي مثبت پاسي تي افزوده آهي، جنهن جي نتيجي ۾ هڪ ننڍڙو گريڊينٽ آهي، رائبوسومل پروٽين PC1 جي ٻنهي طرفن ۾ ورهاڱي کي هلائي ٿو (شڪل 3A). PC1 جي منفي پاسي تي افزوده رائبوسومل پروٽين ۾ RPL18، RPS18، ۽ RPS13 (شڪل 3B) شامل هئا، جڏهن ته RPL31، RPL35، ۽ RPL38 (شڪل 3C) PC1 جي مثبت پاسي تي مکيه ڊرائيور هئا. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، RPL38 ۽ RPS13 ٻين ٽشوز جي مقابلي ۾ اسڪيلٽل عضلات ۾ تمام گهڻو ظاهر ڪيا ويا (ضمني شڪل 7A). PC1 ۾ اهي مخصوص رائبوسومل دستخط ٽرانسڪرپٽوم (ضمني شڪل 7B) ۾ نه ڏٺا ويا، جيڪي پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن کي ظاهر ڪن ٿا.
الف. پروٽوم ۾ سائٽوپلاسمڪ رائبوسومل جين آنٽولوجي (GO) جي اصطلاحن جي مطابق رنگيل پرنسپل ڪمپونينٽ ايناليسس (PCA) پلاٽ. تير PCA پلاٽ ۾ پروٽين جي وچولي تبديلي جي هدايت کي ظاهر ڪن ٿا. لائن جي ڊيگهه ڏنل پروٽين لاءِ پرنسپل ڪمپونينٽ اسڪور سان ملندڙ جلندڙ آهي. بي، سي. RPS13 ۽ RPL38 لاءِ PCA فيچر پلاٽ. ڊي. سائٽوپلاسمڪ رائبوسومل پروٽين جو غير نگراني ٿيل هيئراريڪل ڪلسٽرنگ تجزيو. اي. 80S رائبوسومل (PDB: 4V6X) جو اسٽرڪچرل ماڊل جيڪو اسڪيلٽل عضلاتي فائبر ۾ مختلف ڪثرت سان رائبوسومل پروٽين کي اجاگر ڪري ٿو. ايف. mRNA ايگزٽ چينل جي ويجهو مقامي مختلف اسٽوچيوميٽري سان رائبوسومل پروٽين.
رائبوسومل هيٽروجينيٽي ۽ اسپيشلائيزيشن جا تصور اڳ ۾ پيش ڪيا ويا آهن، جنهن جي ذريعي مختلف رائبوسومل سب پاپوليشنز (رائيبوسومل هيٽروجينيٽي) جي موجودگي مختلف ٽشوز 32 ۽ سيلز 33 ۾ پروٽين جي ترجمي تي سڌو سنئون اثر انداز ٿي سگهي ٿي مخصوص mRNA ٽرانسڪرپٽ پولز 34 (رائيبوسومل اسپيشلائيزيشن) جي چونڊيل ترجمي ذريعي. اسڪيليٽل عضلاتي فائبرز ۾ گڏيل طور تي ظاهر ڪيل رائبوسومل پروٽين جي ذيلي آبادي کي سڃاڻڻ لاءِ، اسان پروٽوم ۾ رائبوسومل پروٽين جو هڪ غير نگراني ٿيل هيراريڪل ڪلسٽرنگ تجزيو ڪيو (شڪل 3D، ضمني ڊيٽا سيٽ 8). جيئن توقع ڪئي وئي، رائبوسومل پروٽين MYH جي بنياد تي فائبر جي قسم جي لحاظ کان ڪلسٽر نه ٿيا. بهرحال، اسان رائبوسومل پروٽين جي ٽن مختلف ڪلسٽرن جي سڃاڻپ ڪئي؛ پهريون ڪلسٽر (رائيبوسومل_ڪلسٽر_1) RPL38 سان گڏ آهي ۽ ان ڪري مثبت PC1 پروفائل سان فائبرن ۾ اظهار وڌايو آهي. ٻيو ڪلسٽر (رائيبوسومل_ڪلسٽر_2) RPS13 سان گڏ آهي ۽ منفي PC1 پروفائل سان فائبرن ۾ بلند آهي. ٽيون ڪلستر (ribosomal_cluster_3) کنڊ جي عضلاتي فائبرن ۾ هم آهنگ فرق جو اظهار نه ٿو ڏيکاري ۽ ان کي "بنيادي" کنڊ جي عضلاتي رائبوسومل پروٽين سمجهي سگهجي ٿو. ٻئي رائبوسومل ڪلستر 1 ۽ 2 ۾ رائبوسومل پروٽين شامل آهن جيڪي اڳ ۾ متبادل ترجمي کي منظم ڪرڻ لاءِ ڏيکاريا ويا آهن (مثال طور، RPL10A، RPL38، RPS19، ۽ RPS25) ۽ ڪارڪردگي طور تي ترقي تي اثر انداز ٿين ٿا (مثال طور، RPL10A، RPL38).34,35,36,37,38 PCA نتيجن سان مطابقت رکندڙ، فائبرن ۾ انهن رائبوسومل پروٽينن جي مشاهدو ڪيل متضاد نمائندگي پڻ تسلسل ڏيکاري ٿي (ضمني شڪل 7C).
رائبوسوم اندر هيٽروجنيئس رائبوسمل پروٽين جي جڳھ کي ڏسڻ لاءِ، اسان انساني 80S رائبوسوم (پروٽين ڊيٽا بينڪ: 4V6X) (شڪل 3E) جو هڪ structural ماڊل استعمال ڪيو. مختلف رائبوسمل ڪلسٽرن سان تعلق رکندڙ رائبوسمل پروٽين کي الڳ ڪرڻ کان پوءِ، انهن جي جڳهن کي ويجهي سان ترتيب نه ڏني وئي، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته اسان جو طريقو رائبوسوم جي ڪجهه علائقن/حصن لاءِ افزودگي فراهم ڪرڻ ۾ ناڪام ٿيو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، ڪلسٽر 2 ۾ وڏي سب يونٽ پروٽين جو تناسب ڪلسٽر 1 ۽ 3 جي ڀيٽ ۾ گهٽ هو (ضمني شڪل 7D). اسان ڏٺو ته اسڪيليٽل عضلاتي فائبرن ۾ تبديل ٿيل اسٽوچيوميٽري سان پروٽين بنيادي طور تي رائبوسوم مٿاڇري (شڪل 3E) تي مقامي هئا، مختلف mRNA آبادي ۾ اندروني رائبوسوم داخلا سائيٽ (IRES) عنصرن سان لهه وچڙ ڪرڻ جي انهن جي صلاحيت سان مطابقت رکن ٿا، انهي ڪري چونڊيل ترجمي کي هم آهنگ ڪن ٿا. 40، 41 ان کان علاوه، اسڪيليٽل عضلاتي فائبرن ۾ تبديل ٿيل اسٽوچيوميٽري سان ڪيترائي پروٽين فنڪشنل علائقن جي ويجهو واقع هئا جهڙوڪ mRNA ايگزٽ سرنگ (شڪل 3F)، جيڪي چونڊيل طور تي مخصوص پيپٽائڊس جي ترجمي جي ڊيگهه ۽ گرفتاري کي منظم ڪن ٿا. 42 خلاصو، اسان جي ڊيٽا مان معلوم ٿئي ٿو ته کنڊ جي عضلاتي رائبوسومل پروٽين جي اسٽوچيوميٽري هيٽروجينيٽي ڏيکاري ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ کنڊ جي عضلاتي فائبرن جي وچ ۾ فرق پيدا ٿئي ٿو.
اسان اڳتي هلي تيز ۽ سست ٽوئچ فائبر دستخطن جي سڃاڻپ ڪرڻ ۽ انهن جي ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن جي ميڪانيزم کي ڳولڻ لاءِ نڪتاسين. ٻن ڊيٽاسيٽس ۾ UMAP پاران بيان ڪيل تيز ۽ سست ٽوئچ فائبر ڪلسٽرن جو مقابلو ڪندي (شڪلون 1G-H ۽ 4A-B)، ٽرانسڪرپٽوميڪ ۽ پروٽوميڪ تجزين ترتيب وار 1366 ۽ 804 مختلف طور تي گهڻيون خاصيتون سڃاڻيون (شڪلون 4A-B، ضمني ڊيٽاسيٽس 9-12). اسان سارڪوميرس (مثال طور، ٽروپوميوسين ۽ ٽروپونين)، ايڪسائيٽيشن-ڪنٽرڪشن ڪوپلنگ (SERCA آئسفارمز)، ۽ توانائي ميٽابولزم (مثال طور، ALDOA ۽ CKB) سان لاڳاپيل دستخطن ۾ متوقع فرق ڏٺو. ان کان علاوه، پروٽين جي ubiquitination کي منظم ڪندڙ ٽرانسڪرپٽس ۽ پروٽين تيز ۽ سست ٽوئچ فائبرن (مثال طور، USP54، SH3RF2، USP28، ۽ USP48) ۾ مختلف طور تي ظاهر ڪيا ويا (شڪلون 4A-B). ان کان علاوه، مائڪروبيل پروٽين جين RP11-451G4.2 (DWORF)، جيڪو اڳ ۾ ليمب عضلاتي فائبر جي قسمن ۾ مختلف طور تي ظاهر ڪيو ويو آهي 43 ۽ دل جي عضلات ۾ SERCA سرگرمي کي وڌائي ٿو 44، سست اسڪيلٽل عضلاتي فائبر ۾ خاص طور تي اپريگيولڊ ڪيو ويو (شڪل 4A). ساڳئي طرح، انفرادي فائبر جي سطح تي، ميٽابولزم سان لاڳاپيل ليڪٽيٽ ڊيهائيڊروجنيز آئسفارمز (LDHA ۽ LDHB، شڪل 4C ۽ ضمني شڪل 8A) 45،46 ۽ اڳ ۾ نامعلوم فائبر قسم جي مخصوص دستخطن (جهڙوڪ IRX3، USP54، USP28، ۽ DPYSL3) (شڪل 4C) ۾ اهم فرق ڏٺو ويو. ٽرانسڪرپٽومڪ ۽ پروٽومڪ ڊيٽاسيٽس (ضمني شڪل 8B) جي وچ ۾ مختلف طور تي ظاهر ڪيل خاصيتن جو هڪ اهم اوورليپ هو، انهي سان گڏ هڪ فولڊ تبديلي جو لاڳاپو بنيادي طور تي سارڪومير خاصيتن جي وڌيڪ واضح فرق جي اظهار جي ذريعي هلائي ٿو (ضمني شڪل 8C). خاص طور تي، ڪجهه دستخط (مثال طور USP28، USP48، GOLGA4، AKAP13) صرف پروٽومڪ سطح تي مضبوط پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن ڏيکاريا ۽ انهن ۾ سست/تيز ٽوئچ فائبر ٽائپ-مخصوص ايڪسپريشن پروفائلز هئا (ضمني شڪل 8C).
A ۽ B آتش فشاني پلاٽ جيڪي شڪل 1G-H ۾ يونيفارم ميني فولڊ پروڪسيميشن ۽ پروجئشن (UMAP) پلاٽن جي سڃاڻپ ڪيل سست ۽ تيز ڪلسٽرن جو مقابلو ڪن ٿا. رنگين نقطا ٽرانسڪرپٽ يا پروٽين جي نمائندگي ڪن ٿا جيڪي FDR < 0.05 تي خاص طور تي مختلف آهن، ۽ ڪارا نقطا ٽرانسڪرپٽ يا پروٽين جي نمائندگي ڪن ٿا جيڪي لاگ تبديلي > 1 تي خاص طور تي مختلف آهن. ٻه طرفي شمارياتي تجزيو DESeq2 والڊ ٽيسٽ استعمال ڪندي بينجمني-هچبرگ ايڊجسٽ ٿيل پي ويليوز (ٽرانسڪرپٽوميڪس) يا ليما لينئر ماڊل طريقو استعمال ڪندي تجرباتي بيزين تجزيي سان ڪيو ويو جنهن کان پوءِ ڪيترن ئي مقابلي (پروٽوميڪس) لاءِ بينجمني-هچبرگ ايڊجسٽمينٽ ڪئي وئي. C سست ۽ تيز فائبرن جي وچ ۾ چونڊيل مختلف طور تي ظاهر ڪيل جين يا پروٽين جا دستخط پلاٽ. D خاص طور تي مختلف طور تي ظاهر ڪيل ٽرانسڪرپٽس ۽ پروٽين جو افزودگي تجزيو. اوورليپنگ قدر ٻنهي ڊيٽاسيٽس ۾ افزوده ڪيا ويا آهن، ٽرانسڪرپٽوم قدر صرف ٽرانسڪرپٽومي ۾ افزوده ڪيا ويا آهن، ۽ پروٽوم قدر صرف پروٽوم ۾ افزوده ڪيا ويا آهن. شمارياتي تجزيو ڪلسٽر پروفيلر پيڪيج استعمال ڪندي بينجمني-هچبرگ ايڊجسٽ ٿيل پي ويليوز سان ڪيو ويو. E. SCENIC پاران سڃاڻپ ڪيل فائبر قسم جي مخصوص ٽرانسڪرپشن عنصر جيڪي SCENIC مان نڪتل ريگيوليٽر جي خاصيت جي اسڪور ۽ فائبر جي قسمن جي وچ ۾ فرق ڪندڙ mRNA اظهار جي بنياد تي آهن. F. سست ۽ تيز فائبر جي وچ ۾ فرق سان ظاهر ڪيل چونڊيل ٽرانسڪرپشن عنصرن جي پروفائلنگ.
پوءِ اسان مختلف طور تي نمائندگي ڪندڙ جينز ۽ پروٽين جو هڪ اوور ريپريزنٽيشن تجزيو ڪيو (شڪل 4D، ضمني ڊيٽا سيٽ 13). ٻن ڊيٽاسيٽس جي وچ ۾ مختلف خاصيتن لاءِ رستو افزودگي متوقع فرق ظاهر ڪيو، جهڙوڪ فيٽي ايسڊ β-آڪسائيڊيشن ۽ ڪيٽون ميٽابولزم عمل (سست فائبر)، مائوفيلامينٽ/عضلات جو ٽڪراءُ (تيز ۽ سست فائبر، ترتيب وار)، ۽ ڪاربوهائيڊريٽ ڪيٽابولڪ عمل (تيز فائبر). تيز فائبرن ۾ سيرين/ٿريونين پروٽين فاسفيٽيس سرگرمي پڻ وڌي وئي، جيڪا ريگيوليٽري ۽ ڪيٽيليٽڪ فاسفيٽيس سب يونٽس (PPP3CB، PPP1R3D، ۽ PPP1R3A) جهڙين خاصيتن جي ڪري هلائي وئي، جيڪي گلائڪوجن ميٽابولزم کي منظم ڪرڻ لاءِ سڃاتل آهن (47) (اضافي شڪلون 8D-E). تيز فائبرن سان مالا مال ٻين رستن ۾ پروٽيم ۾ پروسيسنگ (P-) باڊيز (YTHDF3، TRIM21، LSM2) شامل آهن (ضمني شڪل 8F)، امڪاني طور تي پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن ۾ شامل آهن (48)، ۽ ٽرانسڪرپشن فيڪٽر سرگرمي (SREBF1، RXRG، RORA) ٽرانسڪرپٽوم ۾ (ضمني شڪل 8G). سست فائبر آڪسائيڊورڊيڪٽيس سرگرمي (BDH1، DCXR، TXN2) (ضمني شڪل 8H)، امائيڊ بائنڊنگ (CPTP، PFDN2، CRYAB) (ضمني شڪل 8I)، ايڪسٽرا سيلولر ميٽرڪس (CTSD، ADAMTSL4، LAMC1) (ضمني شڪل 8J)، ۽ ريڪٽر-لائگينڊ سرگرمي (FNDC5، SPX، NENF) (ضمني شڪل 8K) ۾ مالا مال هئا.
سست/تيز عضلاتي فائبر قسم جي خاصيتن جي بنياد تي ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن ۾ وڌيڪ بصيرت حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان SCENIC49 (سپليمينٽري ڊيٽا سيٽ 14) استعمال ڪندي ٽرانسڪرپشن فيڪٽر افزودگي تجزيو ڪيو. تيز ۽ سست عضلاتي فائبرن جي وچ ۾ ڪيترائي ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز خاص طور تي افزوده ڪيا ويا (شڪل 4E). ان ۾ ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز جهڙوڪ MAFA، جيڪو اڳ ۾ تيز عضلاتي فائبر جي ترقي سان ڳنڍيل آهي، 50 ۽ گڏوگڏ ڪيترائي ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز شامل هئا جيڪي اڳ ۾ عضلاتي فائبر جي قسم جي مخصوص جين پروگرامن سان لاڳاپيل نه هئا. انهن مان، PITX1، EGR1، ۽ MYF6 تيز عضلاتي فائبرن ۾ سڀ کان وڌيڪ افزوده ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز هئا (شڪل 4E). ان جي ابتڙ، ZSCAN30 ۽ EPAS1 (جنهن کي HIF2A پڻ چيو ويندو آهي) سست عضلاتي فائبرن ۾ سڀ کان وڌيڪ افزوده ٽرانسڪرپشن فيڪٽرز هئا (شڪل 4E). ان سان مطابقت رکندڙ، MAFA تيز عضلاتي فائبرن جي مطابق UMAP علائقي ۾ اعليٰ سطحن تي ظاهر ڪيو ويو، جڏهن ته EPAS1 ۾ مخالف اظهار جو نمونو هو (شڪل 4F).
سڃاتل پروٽين-ڪوڊنگ جينز کان علاوه، ڪيترائي نان-ڪوڊنگ آر اين اي بايو ٽائپس آهن جيڪي انساني ترقي ۽ بيماري جي ضابطي ۾ شامل ٿي سگهن ٿا. 51، 52 ٽرانسڪرپٽوم ڊيٽاسيٽس ۾، ڪيترائي نان-ڪوڊنگ آر اين اي فائبر قسم جي خاصيت ڏيکارين ٿا (شڪل 5A ۽ ضمني ڊيٽاسيٽ 15)، جنهن ۾ LINC01405 شامل آهي، جيڪو سست فائبرن لاءِ انتهائي مخصوص آهي ۽ مائيٽوڪونڊريل مايوپيٿي جي مريضن کان عضلات ۾ گهٽتائي جي رپورٽ ڪئي وئي آهي. 53 ان جي ابتڙ، RP11-255P5.3، lnc-ERCC5-5 جين (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 سان لاڳاپيل، تيز فائبر قسم جي خاصيت ڏيکاري ٿو. ٻئي LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) ۽ RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) کنڊ جي عضلات جي خاصيت کي ظاهر ڪن ٿا (اضافي شڪلون 9A-B) ۽ انهن جي 1 Mb جينومڪ پاڙيسري ۾ ڪو به معلوم ڪانٽريڪٽائل جين نه آهي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي پاڙيسري ڪانٽريڪٽائل جين کي منظم ڪرڻ جي بدران فائبر جي قسمن کي منظم ڪرڻ ۾ هڪ خاص ڪردار ادا ڪن ٿا. LINC01405 ۽ RP11-255P5.3 جي سست/تيز فائبر قسم جي مخصوص اظهار جي پروفائلز، ترتيب وار، RNAscope استعمال ڪندي تصديق ڪئي وئي (شڪلون 5B-C).
الف. نان ڪوڊنگ آر اين اي ٽرانسڪرپٽس سست ۽ تيز ٽوئچ عضلاتي فائبرن ۾ خاص طور تي منظم ڪيا ويندا آهن. ب. نمائندگي ڪندڙ آر اين اي اسڪوپ تصويرون جيڪي ترتيب وار LINC01405 ۽ RP11-255P5.3 جي سست ۽ تيز ٽوئچ فائبر قسم جي خاصيت ڏيکارين ٿيون. اسڪيل بار = 50 μm. ج. آر اين اي اسڪوپ پاران طئي ڪيل مائيو فائبر قسم جي مخصوص نان ڪوڊنگ آر اين اي اظهار جي مقدار (n = 3 بايوپسي آزاد فردن کان، هر فرد اندر تيز ۽ سست عضلاتي فائبرن جو مقابلو ڪندي). شمارياتي تجزيو ٻن-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي ڪيو ويو. باڪس پلاٽ وچين ۽ پهرين ۽ ٽئين ڪوارٽائل ڏيکارين ٿا، وسڪر گهٽ ۾ گهٽ ۽ وڌ ۾ وڌ قدرن ڏانهن اشارو ڪندي. د. ڊي نوو مائڪروبيل پروٽين جي سڃاڻپ ورڪ فلو (BioRender.com سان ٺاهيل). E. مائڪروبيل پروٽين LINC01405_ORF408:17441:17358 خاص طور تي سست اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي (آزاد شرڪت ڪندڙن کان n=5 بايوپسي، هر شرڪت ڪندڙ ۾ تيز ۽ سست عضلاتي فائبرن جو مقابلو ڪندي). شمارياتي تجزيو لِم لينئر ماڊل طريقو استعمال ڪندي ڪيو ويو جيڪو تجرباتي بيزين طريقو سان گڏ ڪيو ويو، جنهن کان پوءِ پي-ويليو ايڊجسٽمينٽ سان ڪيترن ئي مقابلي لاءِ بينجمني-هچبرگ طريقو استعمال ڪيو ويو. باڪس پلاٽ وچين، پهرين ۽ ٽئين چوٿين کي ڏيکارين ٿا، جن ۾ وسڪر وڌ ۾ وڌ/گهٽ ۾ گهٽ قدرن ڏانهن اشارو ڪن ٿا.
حال ۾، مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته ڪيترائي پوٽيٽو نان ڪوڊنگ ٽرانسڪرپٽ ٽرانسڪرپٽ ٿيل مائڪروبيل پروٽين کي انڪوڊ ڪن ٿا، جن مان ڪجهه عضلات جي ڪم کي منظم ڪن ٿا. 44، 55 امڪاني فائبر قسم جي خاصيت سان مائڪروبيل پروٽين جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ، اسان 1000 فائبر پروٽوم ڊيٽاسيٽ (شڪل 5D) ۾ مليل نان ڪوڊنگ ٽرانسڪرپٽ (n = 305) جي تسلسل تي مشتمل هڪ ڪسٽم FASTA فائل استعمال ڪندي پنهنجي 1000 فائبر پروٽوم ڊيٽاسيٽ کي ڳوليو. اسان 22 مختلف ٽرانسڪرپٽ مان 197 مائڪروبيل پروٽين جي سڃاڻپ ڪئي، جن مان 71 سست ۽ تيز اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي وچ ۾ مختلف طور تي منظم ڪيا ويا هئا (ضمني شڪل 9C ۽ ضمني ڊيٽا سيٽ 16). LINC01405 لاءِ، ٽي مائڪروبيل پروٽين پراڊڪٽس جي سڃاڻپ ڪئي وئي، جن مان هڪ ان جي ٽرانسڪرپٽ سان ملندڙ سست فائبر جي خاصيت ڏيکاري ٿي (شڪل 5E ۽ ضمني شڪل 9D). اهڙي طرح، اسان LINC01405 کي هڪ جين جي طور تي سڃاڻپ ڪيو جيڪو سست اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن لاءِ مخصوص مائڪروبيل پروٽين کي انڪوڊ ڪري ٿو.
اسان انفرادي عضلاتي فائبرن جي وڏي پيماني تي پروٽومڪ خاصيت لاءِ هڪ جامع ورڪ فلو تيار ڪيو ۽ صحتمند حالتن ۾ فائبر هيٽروجينيٽي جي سڃاڻپ ڪندڙ ريگيوليٽرز. اسان هن ورڪ فلو کي اهو سمجهڻ لاءِ لاڳو ڪيو ته ڪيئن نيمالائن ميوپيٿيون اسڪيلٽل عضلاتي فائبر هيٽروجينيٽي کي متاثر ڪن ٿيون. نيمالائن ميوپيٿيون وراثت ۾ مليل عضلاتي بيماريون آهن جيڪي عضلات جي ڪمزوري جو سبب بڻجن ٿيون ۽ متاثر ٻارن ۾، سانس جي تڪليف، اسڪوليوسس، ۽ محدود عضون جي حرڪت سميت مختلف پيچيدگين سان گڏ موجود آهن. 19,20 عام طور تي، نيمالائن ميوپيٿين ۾، جينز ۾ پيٿوجينڪ قسم جهڙوڪ ايڪٽين الفا 1 (ACTA1) جي نتيجي ۾ سست-ٽوچ فائبر مايوفيبر ساخت جي غالب هوندي آهي، جيتوڻيڪ هي اثر متضاد آهي. هڪ قابل ذڪر استثنا ٽروپونين T1 نيمالائن ميوپيٿي (TNNT1) آهي، جنهن ۾ تيز فائبرن جي غالب آهي. اهڙيءَ طرح، نيمالائن ميوپيٿين ۾ مشاهدو ڪيل اسڪيلٽل عضلاتي فائبر جي خرابي جي بنياد تي هيٽروجينيٽي جي بهتر سمجھ انهن بيمارين ۽ مايوفيبر قسم جي وچ ۾ پيچيده تعلق کي ختم ڪرڻ ۾ مدد ڪري سگهي ٿي.
صحتمند ڪنٽرولن (n=3 في گروپ) جي مقابلي ۾، ACTA1 ۽ TNNT1 جين ۾ ميوٽيشنز سان نيمالائن مايوپيٿي مريضن کان الڳ ٿيل مايوفيبرز نشان لڳل مايوفيبر ايٽروفي يا ڊسٽروفي ڏيکاريا (شڪل 6A، ضمني جدول 3). هن محدود مقدار ۾ موجود مواد جي ڪري پروٽومڪ تجزيو لاءِ اهم ٽيڪنيڪل چئلينج پيش ڪيا. ان جي باوجود، اسان 272 اسڪيليٽل مايوفيبرز ۾ 2485 پروٽين ڳولڻ جي قابل هئاسين. في فائبر گهٽ ۾ گهٽ 1000 مقداري پروٽين لاءِ فلٽر ڪرڻ کان پوءِ، 250 فائبرن کي بعد ۾ بايو انفارميٽڪس تجزيو جي تابع ڪيو ويو. فلٽر ڪرڻ کان پوءِ، في فائبر سراسري طور تي 1573 ± 359 پروٽينن جي مقداري ڪئي وئي (ضمني شڪل 10A، ضمني ڊيٽا سيٽ 17-18). خاص طور تي، فائبر جي سائيز ۾ اهم گهٽتائي جي باوجود، نيمالائن مايوپيٿي مريضن جي نمونن جي پروٽوم کوٽائي صرف معمولي طور تي گهٽجي وئي. ان کان علاوه، اسان جي پنهنجي FASTA فائلن (نان ڪوڊنگ ٽرانسڪرپٽس سميت) استعمال ڪندي انهن ڊيٽا کي پروسيس ڪرڻ سان اسان کي نيملين مايوپيٿي مريضن مان اسڪيلٽل مايو فائبرز ۾ پنج مائڪروبيل پروٽين جي سڃاڻپ ڪرڻ جي اجازت ملي (سپليمينٽري ڊيٽا سيٽ 19). پروٽيم جي متحرڪ حد تمام گهڻي وسيع هئي، ۽ ڪنٽرول گروپ ۾ ڪل پروٽين اڳوڻي 1000-فائبر پروٽيم تجزيي جي نتيجن سان چڱي طرح لاڳاپيل هئا (سپليمينٽري شڪل 10B-C).
الف. مائڪرو اسڪوپڪ تصويرون جيڪي فائبر ايٽروفي يا ڊسٽروفي ۽ ACTA1 ۽ TNNT1 نيملين مايوپيٿيز (NM) ۾ MYH جي بنياد تي مختلف فائبر قسمن جي غلبي کي ڏيکارين ٿيون. اسڪيل بار = 100 μm. ACTA1 ۽ TNNT1 مريضن ۾ داغ جي ٻيهر پيداوار کي يقيني بڻائڻ لاءِ، نمائندگي ڪندڙ تصويرن کي چونڊڻ کان اڳ ٽن مريضن جي بايوپسي کي ٻه کان ٽي ڀيرا (في ڪيس چار حصا) داغ ڏنو ويو. ب. MYH جي بنياد تي شرڪت ڪندڙن ۾ فائبر قسم جو تناسب. ج. نيملين مايوپيٿيز ۽ ڪنٽرولز وارن مريضن ۾ کنڊ جي عضلاتي فائبرن جو پرنسپل جزو تجزيو (PCA) پلاٽ. د. نيملين مايوپيٿيز ۽ ڪنٽرولز وارن مريضن مان کنڊ جي عضلاتي فائبر هڪ PCA پلاٽ تي پيش ڪيا ويا آهن جيڪي شڪل 2 ۾ تجزيو ڪيل 1000 فائبرن مان طئي ڪيا ويا آهن. مثال طور، آتش فشاني پلاٽ ACTA1 ۽ TNNT1 نيملين مايوپيٿيز ۽ ڪنٽرولز وارن شرڪت ڪندڙن جي وچ ۾ فرق جو مقابلو ڪن ٿا، ۽ ACTA1 ۽ TNNT1 نيملين مايوپيٿيز وارن شرڪت ڪندڙن جي وچ ۾. رنگين دائرا پروٽين کي ظاهر ڪن ٿا جيڪي π < 0.05 تي خاص طور تي مختلف هئا، ۽ ڪارا نقطا پروٽين کي ظاهر ڪن ٿا جيڪي FDR < 0.05 تي خاص طور تي مختلف هئا. شمارياتي تجزيو ليما لڪير ماڊل طريقو ۽ تجرباتي بيزين طريقن کي استعمال ڪندي ڪيو ويو، جنهن کان پوءِ بينجمني-هچبرگ طريقو استعمال ڪندي ڪيترن ئي مقابلي لاءِ پي-ويليو ايڊجسٽمينٽ ڪيو ويو. ايڇ. پوري پروٽيم ۽ ٽائپ 1 ۽ 2A فائبر ۾ اهم طور تي مختلف طور تي ظاهر ڪيل پروٽين جي افزودگي جو تجزيو. ڪلسٽر پروفائلر پيڪيج ۽ بينجمني-هچبرگ ترتيب ڏنل پي-ويليوز استعمال ڪندي شمارياتي تجزيو ڪيو ويو. I، J. پرنسپل جزو تجزيو (PCA) پلاٽ ايڪسٽرا سيلولر ميٽرڪس ۽ مائيٽوڪونڊريل جين آنٽولوجي (GO) اصطلاحن سان رنگين.
ڇاڪاڻ ته نيمالائن مايوپيٿي اسڪيلٽل عضلات ۾ MYH-اظهار ڪندڙ مايوفيبر قسمن جي تناسب تي اثر انداز ٿي سگهن ٿا، 19,20 اسان پهريون ڀيرو نيمالائن مايوپيٿي ۽ ڪنٽرول وارن مريضن ۾ MYH-اظهار ڪندڙ مايوفيبر قسمن جو جائزو ورتو. اسان 1000 مايوفيبر ايسي (سپليمينٽري شڪلون 10D-E) لاءِ اڳ ۾ بيان ڪيل هڪ غير جانبدار طريقو استعمال ڪندي مايوفيبر قسم جو تعين ڪيو ۽ ٻيهر خالص 2X مايوفيبرز (شڪل 6B) جي سڃاڻپ ڪرڻ ۾ ناڪام ٿيا. اسان مايوفيبر قسم تي نيمالائن مايوپيٿيز جو هڪ متفاوت اثر ڏٺو، ڇاڪاڻ ته ACTA1 ميوٽيشنز سان ٻن مريضن ۾ قسم 1 مايوفيبرز جو تناسب وڌي ويو هو، جڏهن ته TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي سان ٻن مريضن ۾ قسم 1 مايوفيبرز جو تناسب گهٽجي ويو هو (شڪل 6B). حقيقت ۾، ACTA1-نيمالائن مايوپيٿي ۾ MYH2 ۽ فاسٽ ٽروپونين آئسفارمز (TNNC2، TNNI2، ۽ TNNT3) جو اظهار گهٽجي ويو، جڏهن ته TNNT1-نيمالائن مايوپيٿي ۾ MYH7 جو اظهار گهٽجي ويو (ضمني شڪل 11A). هي نيمالائن مايوپيٿي ۾ هيٽروجنيئس مايوفائبر قسم جي سوئچنگ جي پوئين رپورٽن سان مطابقت رکي ٿو. 19,20 اسان امونوهسٽو ڪيمسٽري ذريعي انهن نتيجن جي تصديق ڪئي ۽ ڏٺو ته ACTA1-نيمالائن مايوپيٿي سان مريضن ۾ قسم 1 مايوفائبرز جي برتري هئي، جڏهن ته TNNT1-نيمالائن مايوپيٿي سان مريضن ۾ مخالف نمونو هو (شڪل 6A).
سنگل فائبر پروٽيم ليول تي، ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي مريضن مان اسڪيلٽل عضلاتي فائبر ڪنٽرول فائبرن جي اڪثريت سان گڏ گڏ ٿيا، TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي فائبر عام طور تي سڀ کان وڌيڪ متاثر ٿيا (شڪل 6C). اهو خاص طور تي واضح هو جڏهن هر مريض لاءِ سيوڊو-انفلاٽڊ فائبرن جي پرنسپل جزو تجزيو (PCA) پلاٽن کي پلاٽ ڪندي، TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي مريض 2 ۽ 3 ڪنٽرول نمونن کان سڀ کان وڌيڪ پري نظر اچن ٿا (ضمني شڪل 11B، ضمني ڊيٽا سيٽ 20). بهتر سمجهڻ لاءِ ته مايوپيٿي مريضن مان فائبر صحتمند فائبرن سان ڪيئن مقابلو ڪن ٿا، اسان صحتمند بالغ شرڪت ڪندڙن کان 1,000 فائبرن جي پروٽيمڪ تجزيي مان حاصل ڪيل تفصيلي معلومات استعمال ڪئي. اسان مايوپيٿي ڊيٽا سيٽ (ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي مريض ۽ ڪنٽرول) مان فائبرن کي 1000-فائبر پروٽيمڪ تجزيو (شڪل 6D) مان حاصل ڪيل PCA پلاٽ تي پيش ڪيو. ڪنٽرول فائبرز ۾ PC2 سان گڏ MYH فائبر جي قسمن جي ورڇ 1000-فائبر پروٽومڪ تجزيي مان حاصل ڪيل فائبر جي ورڇ وانگر هئي. تنهن هوندي به، نيمالائن مايوپيٿي جي مريضن ۾ گهڻا فائبر PC2 هيٺ منتقل ٿيا، صحتمند فاسٽ-ٽويچ فائبرز سان اوورليپنگ، انهن جي اصلي MYH فائبر قسم جي پرواهه ڪرڻ کان سواءِ. اهڙيءَ طرح، جيتوڻيڪ ACTA1 نيمالائن مايوپيٿي سان مريضن MYH-بنياد طريقن کي استعمال ڪندي مقدار جي حساب سان ٽائپ 1 فائبرز ڏانهن شفٽ ڏيکاري، ACTA1 نيمالائن مايوپيٿي ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ٻنهي اسڪيليٽل عضلاتي فائبر پروٽوم کي فاسٽ-ٽويچ فائبرز ڏانهن منتقل ڪيو.
پوءِ اسان هر مريض گروپ جو سڌو سنئون صحتمند ڪنٽرول سان مقابلو ڪيو ۽ ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿيز ۾ ترتيب وار 256 ۽ 552 مختلف طور تي ظاهر ڪيل پروٽين جي سڃاڻپ ڪئي (شڪل 6E-G ۽ ضمني شڪل 11C، ضمني ڊيٽا سيٽ 21). جين جي افزودگي جي تجزيي ۾ مائيٽوڪونڊريل پروٽين ۾ هڪ هم آهنگ گهٽتائي ظاهر ڪئي وئي (شڪل 6H-I، ضمني ڊيٽا سيٽ 22). حيرت انگيز طور تي، ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿيز ۾ فائبر جي قسمن جي فرق جي غالب هجڻ جي باوجود، هي گهٽتائي MYH تي ٻڌل فائبر جي قسم کان مڪمل طور تي آزاد هئي (شڪل 6H ۽ ضمني شڪل 11D-I، ضمني ڊيٽا سيٽ 23). ٽي مائڪروبيل پروٽين پڻ ACTA1 يا TNNT1 نيمالائن مايوپيٿيز ۾ منظم ڪيا ويا. انهن مان ٻه مائڪروپروٽين، ENSG00000215483_TR14_ORF67 (جيڪي LINC00598 يا Lnc-FOXO1 جي نالي سان پڻ سڃاتل آهن) ۽ ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2)، صرف قسم 1 مائوفائبرز ۾ فرق جي گهڻائي ڏيکاري. ENSG00000215483_TR14_ORF67 کي اڳ ۾ سيل سائيڪل جي ضابطي ۾ ڪردار ادا ڪرڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي. 56 ٻئي طرف، ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 جي مطابق) صحتمند ڪنٽرول جي مقابلي ۾ ACTA1-نيمالائن مايوپيٿي ۾ قسم 1 ۽ قسم 2A مائوفائبرز ٻنهي ۾ وڌايو ويو (ضمني شڪل 12A، ضمني ڊيٽا سيٽ 24). ان جي ابتڙ، رائبوسومل پروٽين گهڻو ڪري نيمالائن مايوپيٿي کان متاثر نه ٿيا، جيتوڻيڪ RPS17 کي ACTA1 نيمالائن مايوپيٿي (شڪل 6E) ۾ گهٽايو ويو.
افزودگي جي تجزيي ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ مدافعتي نظام جي عملن جي اپ ريگيوليشن کي پڻ ظاهر ڪيو، جڏهن ته TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ سيل آسنجن پڻ وڌي وئي (شڪل 6H). انهن خارجي سيلولر عنصرن جي افزودگي کي خارجي سيلولر ميٽرڪس پروٽين پاران ظاهر ڪيو ويو جيڪي PC1 ۽ PC2 ۾ PCA کي منفي طرف منتقل ڪري رهيا هئا (يعني، سڀ کان وڌيڪ متاثر ٿيل فائبرن ڏانهن) (شڪل 6J). ٻنهي مريض گروپن مدافعتي ردعمل ۽ سارڪوليمل مرمت جي ميڪانيزم ۾ شامل خارجي سيلولر پروٽين جي وڌندڙ اظهار کي ڏيکاريو، جهڙوڪ اينڪسين (ANXA1، ANXA2، ANXA5)57،58 ۽ انهن جي رابطي واري پروٽين S100A1159 (ضمني شڪل 12B-C). هن عمل کي اڳ ۾ عضلاتي ڊسٽروفيز ۾ وڌائڻ جي رپورٽ ڪئي وئي آهي 60 پر، اسان جي ڄاڻ موجب، اڳ ۾ نيمالائن مايوپيٿي سان لاڳاپيل نه ڪيو ويو آهي. زخم کان پوءِ سارڪوليمل مرمت ۽ نئين ٺهيل مايو سائٽس جي مايو فائبرز سان فيوزن لاءِ هن ماليڪيولر مشينري جو عام ڪم ضروري آهي 58,61. اهڙيءَ طرح، ٻنهي مريضن جي گروپن ۾ هن عمل جي وڌندڙ سرگرمي مائي فائبر جي عدم استحڪام جي ڪري ٿيندڙ زخم جي بحالي واري جواب جو مشورو ڏئي ٿي.
هر نيمالائن مايوپيٿي جا اثر چڱيءَ طرح سان لاڳاپيل هئا (r = 0.736) ۽ مناسب اوورليپ ڏيکاريا (ضمني شڪلون 11A–B)، اهو ظاهر ڪري ٿو ته ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي جا پروٽيم تي ساڳيا اثر آهن. بهرحال، ڪجهه پروٽين صرف ACTA1 يا TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ منظم ڪيا ويا (ضمني شڪلون 11A ۽ C). پروفائيبروٽڪ پروٽين MFAP4 TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ سڀ کان وڌيڪ اپريگيولڊ پروٽين مان هڪ هو پر ACTA1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ تبديل نه ٿيو. SKIC8، PAF1C ڪمپليڪس جو هڪ جزو جيڪو HOX جين ٽرانسڪرپشن کي منظم ڪرڻ جو ذميوار آهي، TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ گهٽجي ويو پر ACTA1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ متاثر نه ٿيو (ضمني شڪل 11A). ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي جي سڌي مقابلي ۾ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ مائيٽوڪونڊريل پروٽين ۾ وڌيڪ گهٽتائي ۽ مدافعتي نظام جي پروٽين ۾ واڌ ظاهر ٿي (شڪل 6G-H ۽ ضمني شڪلون 11C ۽ 11H-I). اهي ڊيٽا TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي ۾ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي (شڪل 6A) جي مقابلي ۾ مشاهدو ڪيل وڏي ايٽروفي/ڊسٽروفي سان مطابقت رکن ٿا، اهو مشورو ڏئي ٿو ته TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي بيماري جي وڌيڪ سخت شڪل جي نمائندگي ڪري ٿي.
اهو جائزو وٺڻ لاءِ ته ڇا نيمالائن مايوپيٿي جا مشاهدو ڪيل اثر پوري عضلاتي سطح تي برقرار رهن ٿا، اسان TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي جي مريضن جي ساڳئي ڪوهورٽ مان عضلاتي بايوپسي جو هڪ بلڪ پروٽومڪ تجزيو ڪيو ۽ انهن جو مقابلو ڪنٽرولز (n=3 في گروپ) سان ڪيو (ضمني شڪل 13A، ضمني ڊيٽا سيٽ 25). جيئن توقع ڪئي وئي، ڪنٽرولز پرنسپل جزو جي تجزيي ۾ ويجهي سان لاڳاپيل هئا، جڏهن ته TNNT1 نيمالائن مايوپيٿي جي مريضن سنگل فائبر تجزيي ۾ ڏٺو ويو آهي (ضمني شڪل 13B) جي برابر اعليٰ انٽرسمپل متغيريت جو مظاهرو ڪيو. بلڪ تجزيي انفرادي فائبرن جي مقابلي ڪندي نمايان ٿيل مختلف طور تي ظاهر ڪيل پروٽين (ضمني شڪل 13C، ضمني ڊيٽا سيٽ 26) ۽ حياتياتي عملن (ضمني شڪل 13D، ضمني ڊيٽا سيٽ 27) کي ٻيهر پيدا ڪيو، پر مختلف فائبر جي قسمن جي وچ ۾ فرق ڪرڻ جي صلاحيت وڃائي ڇڏي ۽ فائبرن ۾ متضاد بيماري جي اثرات جو حساب ڏيڻ ۾ ناڪام ٿيا.
گڏ ڪيل، اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته سنگل-مائيوفائبر پروٽومڪس ڪلينڪل حياتياتي خاصيتن کي واضح ڪري سگهن ٿا جيڪي ٽارگيٽ طريقن جهڙوڪ امونوبلوٽنگ ذريعي نه ڳولي سگهجن ٿيون. ان کان علاوه، اهي ڊيٽا فينوٽائپڪ موافقت کي بيان ڪرڻ لاءِ صرف ايڪٽين فائبر ٽائيپنگ (MYH) استعمال ڪرڻ جي حدن کي اجاگر ڪن ٿا. حقيقت ۾، جيتوڻيڪ فائبر قسم جي سوئچنگ ايڪٽين ۽ ٽراپونين نيمالائن مايوپيٿيز جي وچ ۾ مختلف آهي، ٻئي نيمالائن مايوپيٿيز MYH فائبر ٽائيپنگ کي اسڪيليٽل عضلاتي فائبر ميٽابولزم کان تيز ۽ گهٽ آڪسائيڊيوٽيو عضلاتي پروٽوم ڏانهن ڌار ڪن ٿا.
سيلولر هيٽروجينيٽي ٽشوز لاءِ انهن جي مختلف گهرجن کي پورو ڪرڻ لاءِ اهم آهي. اسڪيلٽ عضلات ۾، ان کي اڪثر فائبر جي قسمن جي طور تي بيان ڪيو ويندو آهي جيڪي قوت جي پيداوار ۽ ٿڪاوٽ جي مختلف درجن سان منسوب آهن. بهرحال، اهو واضح آهي ته اهو صرف اسڪيلٽ عضلات فائبر جي متغير جو هڪ ننڍڙو حصو بيان ڪري ٿو، جيڪو اڳ ۾ سوچيو ويو کان گهڻو وڌيڪ متغير، پيچيده ۽ گهڻ رخي آهي. ٽيڪنالاجي ترقي هاڻي اسڪيلٽ عضلات فائبر کي منظم ڪرڻ وارن عنصرن تي روشني وجهي آهي. حقيقت ۾، اسان جو ڊيٽا مشورو ڏئي ٿو ته قسم 2X فائبر شايد هڪ الڳ اسڪيلٽ عضلات فائبر ذيلي قسم نه هجي. ان کان علاوه، اسان ميٽابولڪ پروٽين، رائبوسومل پروٽين ۽ سيل سان لاڳاپيل پروٽين کي اسڪيلٽ عضلات فائبر هيٽروجينيٽي جي اهم تعين ڪندڙن جي طور تي سڃاڻپ ڪيو. نيماٽوڊ ميوپيٿي سان مريضن جي نمونن تي اسان جي پروٽومڪ ورڪ فلو کي لاڳو ڪندي، اسان وڌيڪ ظاهر ڪيو ته MYH تي ٻڌل فائبر ٽائپنگ مڪمل طور تي اسڪيلٽ عضلات هيٽروجينيٽي کي ظاهر نٿو ڪري، خاص طور تي جڏهن سسٽم خراب هجي. حقيقت ۾، MYH تي ٻڌل فائبر جي قسم کان سواءِ، نيماٽوڊ ميوپيٿي تيز ۽ گهٽ آڪسائيڊيوٽ فائبر ڏانهن منتقلي جو نتيجو آهي.
19 صدي کان وٺي اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي درجه بندي ڪئي وئي آهي. تازو اومڪس تجزين اسان کي مختلف MYH فائبر قسمن جي اظهار جي پروفائلز ۽ مختلف محرکن جي جوابن کي سمجهڻ شروع ڪرڻ جي اجازت ڏني آهي. جيئن هتي بيان ڪيو ويو آهي، اومڪس طريقن ۾ روايتي اينٽي باڊي تي ٻڌل طريقن جي ڀيٽ ۾ فائبر قسم جي مارڪرز جي مقدار جي لحاظ کان وڌيڪ حساسيت جو فائدو پڻ آهي، هڪ واحد (يا ڪجهه) مارڪرز جي مقدار تي ڀروسو ڪرڻ کان سواءِ هڪ اسڪيلٽل عضلاتي فائبر جي قسم کي بيان ڪرڻ لاءِ. اسان مڪمل ٽرانسڪرپٽوميڪ ۽ پروٽوميڪ ورڪ فلو استعمال ڪيو ۽ نتيجن کي ضم ڪيو ته جيئن انساني اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن ۾ فائبر هيٽروجينيٽي جي ٽرانسڪرپشنل ۽ پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ريگيوليشن کي جانچيو وڃي. هن ورڪ فلو جي نتيجي ۾ اسان جي صحتمند نوجوانن جي ڪوهورٽ جي ويسٽس ليٽرالس ۾ پروٽين جي سطح تي خالص 2X قسم جي فائبرن جي سڃاڻپ ڪرڻ ۾ ناڪامي ٿي. اهو پوئين سنگل فائبر مطالعي سان مطابقت رکي ٿو جنهن ۾ صحتمند ويسٽس ليٽرالس ۾ <1٪ خالص 2X فائبر مليا، جيتوڻيڪ مستقبل ۾ ٻين عضلات ۾ ان جي تصديق ٿيڻ گهرجي. mRNA سطح تي تقريبن خالص 2X فائبرن ۽ پروٽين جي سطح تي صرف مخلوط 2A/2X فائبرن جي ڳولا جي وچ ۾ فرق حيران ڪندڙ آهي. MYH isoform mRNA اظهار سرڪيڊين نه آهي، 67 اهو مشورو ڏئي ٿو ته اسان RNA سطح تي ظاهري طور تي خالص 2X فائبرن ۾ MYH2 شروعات سگنل کي "مس" ڪرڻ جو امڪان ناهي. هڪ ممڪن وضاحت، جيتوڻيڪ خالص طور تي فرضي، MYH isoforms جي وچ ۾ پروٽين ۽/يا mRNA استحڪام ۾ فرق ٿي سگهي ٿو. حقيقت ۾، ڪو به تيز فائبر ڪنهن به MYH isoform لاءِ 100٪ خالص نه آهي، ۽ اهو واضح ناهي ته ڇا 70-90٪ رينج ۾ MYH1 mRNA اظهار جي سطح پروٽين جي سطح تي MYH1 ۽ MYH2 جي برابر مقدار ۾ نتيجو ڪڍندي. جڏهن ته، جڏهن پوري ٽرانسڪرپٽوم يا پروٽوم تي غور ڪيو وڃي، ڪلسٽر تجزيو اعتماد سان صرف ٻه الڳ ڪلسٽرن جي سڃاڻپ ڪري سگهي ٿو جيڪي سست ۽ تيز اسڪيلٽل عضلاتي فائبرن جي نمائندگي ڪن ٿا، قطع نظر انهن جي صحيح MYH ساخت جي. اهو سنگل-نيوڪليس ٽرانسڪرپٽومي طريقن کي استعمال ڪندي تجزين سان مطابقت رکي ٿو، جيڪي عام طور تي صرف ٻه الڳ مايونيوڪليئر ڪلسٽرن جي سڃاڻپ ڪن ٿا. 68، 69، 70 وڌيڪ، جيتوڻيڪ پوئين پروٽومڪ مطالعي ۾ قسم 2X فائبر جي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، اهي فائبر باقي تيز فائبرن کان الڳ الڳ ڪلستر نه ٿا ڪن ۽ MYH جي بنياد تي ٻين فائبر قسمن جي مقابلي ۾ صرف هڪ ننڍڙي تعداد ۾ مختلف طور تي گهڻا پروٽين ڏيکارين ٿا. 14 اهي نتيجا اهو مشورو ڏين ٿا ته اسان کي عضلاتي فائبر جي درجه بندي جي 20 صدي جي شروعات جي نظر ڏانهن موٽڻ گهرجي، جنهن انساني کنڊ جي عضلاتي فائبرن کي MYH جي بنياد تي ٽن مختلف طبقن ۾ نه، پر انهن جي ميٽابولڪ ۽ ڪانٽريڪٽائل خاصيتن جي بنياد تي ٻن ڪلسٽرن ۾ ورهايو. 63
وڌيڪ اهم ڳالهه اها آهي ته، مائوفائبر هيٽروجينيٽي کي ڪيترن ئي طول و عرض سان غور ڪيو وڃي. پوئين "اومڪس" مطالعي هن طرف اشارو ڪيو آهي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته اسڪيلٽ عضلاتي فائبر ڊسڪريٽ ڪلسٽر نه ٺاهيندا آهن پر هڪ تسلسل سان ترتيب ڏنل آهن. 11، 13، 14، 64، 71 هتي، اسان ڏيکاريون ٿا ته، اسڪيلٽ عضلات جي ڪانٽريڪٽائل ۽ ميٽابولڪ خاصيتن ۾ فرق کان علاوه، مائوفائبرز کي سيل-سيل رابطي ۽ ترجمي جي ميڪانيزم سان لاڳاپيل خاصيتن جي ذريعي فرق ڪري سگهجي ٿو. درحقيقت، اسان اسڪيلٽ عضلاتي فائبرن ۾ رائبوسوم هيٽروجينيٽي ڏٺي جيڪا سست ۽ تيز فائبر جي قسمن کان آزاد هيٽروجينيٽي ۾ حصو وٺندي آهي. هن اهم مائوفائبر هيٽروجينيٽي جو بنيادي سبب، سست ۽ تيز فائبر جي قسم کان آزاد، واضح ناهي، پر اهو عضلاتي فاسيڪلز اندر خاص مقامي تنظيم ڏانهن اشارو ڪري سگهي ٿو جيڪي مخصوص قوتن ۽ لوڊ کي بهتر طور تي جواب ڏين ٿا، 72 عضلاتي مائڪرو ماحول ۾ ٻين سيل قسمن سان خاص سيلولر يا عضون جي مخصوص رابطي 73،74،75 يا انفرادي مائوفائبرز اندر رائبوسوم سرگرمي ۾ فرق. درحقيقت، رائبوسومل هيٽروپلاسمي، يا ته RPL3 ۽ RPL3L جي پيرالوگس متبادل ذريعي يا rRNA جي 2′O-ميٿيليشن جي سطح تي، اسڪيليٽل عضلات جي هائپرٽروفي سان لاڳاپيل ڏيکاريو ويو آهي76,77. ملٽي اومڪ ۽ اسپيشل ايپليڪيشنون انفرادي مائيوفائبرز جي فنڪشنل خاصيت سان گڏ ملٽي اومڪ سطح78 تي عضلات جي حياتيات جي اسان جي سمجھ کي وڌيڪ اڳتي وڌائينديون.
نيمالائن ميوپيٿيز جي مريضن مان سنگل مائيفائبرز جي پروٽيومز جو تجزيو ڪندي، اسان سنگل مائيفائبر پروٽيومس جي افاديت، اثرائتي ۽ لاڳو ٿيڻ جو پڻ مظاهرو ڪيو ته جيئن اسڪيلٽل عضلات جي ڪلينڪل پيٿوفزيولوجي کي واضح ڪري سگهجي. ان کان علاوه، اسان جي ڪم جي فلو کي عالمي پروٽيومي تجزيي سان ڀيٽ ڪندي، اسان اهو ظاهر ڪرڻ جي قابل هئاسين ته سنگل مائيفائبر پروٽيومس عالمي ٽشو پروٽيوميڪس جي معلومات جي ساڳي کوٽائي پيدا ڪري ٿو ۽ انٽرفائبر هيٽروجينيٽي ۽ مائيفائبر قسم جي حساب سان هن کوٽائي کي وڌائي ٿو. صحتمند ڪنٽرولن جي مقابلي ۾ ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن ميوپيٿيز ۾ فائبر قسم جي تناسب ۾ متوقع (جيتوڻيڪ متغير) فرقن کان علاوه، 19 اسان MYH-ثالث فائبر قسم سوئچنگ کان آزاد آڪسائيڊيوٽ ۽ ايڪسٽرا سيلولر ريموڊلنگ جو پڻ مشاهدو ڪيو. TNNT1 نيمالائن مايوپيٿيز ۾ فائبروسس اڳ ۾ رپورٽ ڪيو ويو آهي. 19 جڏهن ته، اسان جو تجزيو هن ڳولا تي ٻڌل آهي، ACTA1 ۽ TNNT1 نيمالائن مايوپيٿيز جي مريضن مان مايو فائبرز ۾ خارجي سيلولر سيڪريٽ ٿيل اسٽريس سان لاڳاپيل پروٽين، جهڙوڪ اينڪسين، جيڪي سارڪوليمل مرمت جي ميڪانيزم ۾ شامل آهن، جي وڌندڙ سطح کي ظاهر ڪندي. 57,58,59 نتيجي ۾، نيمالائن مايوپيٿي جي مريضن مان مايو فائبرز ۾ اينڪسين جي سطح ۾ اضافو شايد سخت ايٽروفڪ مايو فائبرز جي مرمت لاءِ سيلولر ردعمل جي نمائندگي ڪري سگهي ٿو.
جيتوڻيڪ هي مطالعو اڄ تائين انسانن جي سڀ کان وڏي سنگل فائبر پوري عضلاتي اومڪس تجزيي جي نمائندگي ڪري ٿو، اهو حدن کان سواءِ ناهي. اسان شرڪت ڪندڙن جي هڪ نسبتا ننڍڙي ۽ هڪجهڙائي واري نموني ۽ هڪ عضلات (واسٽس ليٽرالس) کان کنڊ جي عضلاتي فائبر کي الڳ ڪيو. تنهن ڪري، عضلات جي قسمن ۽ عضلاتي فزيالوجي جي انتها تي مخصوص فائبر آبادي جي وجود کي خارج ڪرڻ ناممڪن آهي. مثال طور، اسان انتهائي تربيت يافته اسپرنٽرز ۽/يا طاقت واري رانديگرن ۾ يا عضلاتي غير فعالي جي دورن دوران الٽرا فاسٽ فائبر (مثال طور، خالص 2X فائبر) جي هڪ ذيلي سيٽ جي امڪان کي خارج نٿا ڪري سگهون 79. ان کان علاوه، شرڪت ڪندڙن جي محدود نموني جي سائيز اسان کي فائبر هيٽروجينيٽي ۾ جنسي فرق جي جاچ ڪرڻ کان روڪيو، ڇاڪاڻ ته فائبر قسم جي تناسب مردن ۽ عورتن جي وچ ۾ مختلف هجڻ جي ڪري سڃاتل آهن. ان کان علاوه، اسان ساڳئي عضلاتي فائبر يا ساڳئي شرڪت ڪندڙن جي نمونن تي ٽرانسڪرپٽوميڪ ۽ پروٽوميڪ تجزيا ڪرڻ جي قابل نه هئاسين. جيئن ته اسان ۽ ٻيا الٽرا-لو نموني ان پٽ حاصل ڪرڻ لاءِ اومڪس تجزيي کي استعمال ڪندي سنگل سيل ۽ سنگل-مائيوفائبر تجزين کي بهتر بڻائڻ جاري رکون ٿا (جيئن هتي مائيٽوڪونڊريل مايوپيٿي جي مريضن مان فائبرن جي تجزيي ۾ ڏيکاريو ويو آهي)، سنگل عضلاتي فائبرن اندر ملٽي اومڪس (۽ فنڪشنل) طريقن کي گڏ ڪرڻ جو موقعو واضح ٿي ويندو آهي.
مجموعي طور تي، اسان جو ڊيٽا اسڪيليٽل عضلات جي هيٽروجنيٽي جي ٽرانسڪرپشنل ۽ پوسٽ ٽرانسڪرپشنل ڊرائيورن جي سڃاڻپ ۽ وضاحت ڪري ٿو. خاص طور تي، اسان ڊيٽا پيش ڪريون ٿا جيڪو اسڪيليٽل عضلات جي فزيالوجي ۾ هڪ ڊگهي عرصي کان هلندڙ عقيدي کي چئلينج ڪري ٿو جيڪو فائبر جي قسمن جي ڪلاسيڪل MYH تي ٻڌل تعريف سان لاڳاپيل آهي. اسان کي اميد آهي ته بحث کي نئين سر ترتيب ڏينداسين ۽ آخرڪار اسڪيليٽل عضلات فائبر جي درجه بندي ۽ هيٽروجنيٽي جي اسان جي سمجھ تي ٻيهر غور ڪنداسين.
چوڏهن ڪاڪيشين شرڪت ڪندڙ (12 مرد ۽ 2 عورتون) رضاڪارانه طور تي هن مطالعي ۾ حصو وٺڻ تي رضامند ٿيا. مطالعي کي گينٽ يونيورسٽي اسپتال جي اخلاقي ڪميٽي (BC-10237) پاران منظور ڪيو ويو، 2013 جي هيلسنڪي اعلان جي تعميل ڪئي وئي، ۽ ClinicalTrials.gov (NCT05131555) تي رجسٽرڊ ڪيو ويو. شرڪت ڪندڙن جون عام خاصيتون ضمني جدول 1 ۾ پيش ڪيون ويون آهن. زباني ۽ تحريري باخبر رضامندي حاصل ڪرڻ کان پوءِ، شرڪت ڪندڙن مطالعي ۾ آخري شموليت کان اڳ هڪ طبي معائنو ڪرايو. شرڪت ڪندڙ نوجوان (22-42 سال)، صحتمند (ڪابه طبي حالت، سگريٽ نوشي جي تاريخ نه)، ۽ اعتدال پسند جسماني طور تي سرگرم هئا. جسماني تندرستي جو جائزو وٺڻ لاءِ هڪ قدم ارگوميٽر استعمال ڪندي وڌ ۾ وڌ آڪسيجن اپٽيڪ جو تعين ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي. 81
عضلات جي بايوپسي جا نمونا آرام ۽ روزي جي حالت ۾ ٽي ڀيرا گڏ ڪيا ويا، 14 ڏينهن جي وقفي سان. ڇاڪاڻ ته اهي نمونا هڪ ​​وڏي مطالعي جي حصي طور گڏ ڪيا ويا هئا، شرڪت ڪندڙن بايوپسي کان 40 منٽ اڳ پليسبو (ليڪٽوز)، هڪ H1-ريسيپٽر مخالف (540 ملي گرام فيڪسوفيناڊائن)، يا هڪ H2-ريسيپٽر مخالف (40 ملي گرام فيموٽيڊائن) استعمال ڪيو. اسان اڳ ۾ اهو ظاهر ڪيو آهي ته اهي هسٽامائن ريسيپٽر مخالف آرام واري هڏن جي عضلات جي فٽنيس تي اثر انداز نه ٿيندا آهن81، ۽ اسان جي معيار جي ڪنٽرول پلاٽن ۾ ڪا به رياست سان لاڳاپيل ڪلسٽرنگ نه ڏٺي وئي (اضافي شڪلون 3 ۽ 6). هڪ معياري غذا (41.4 ڪيڪال / ڪلوگرام جسماني وزن، 5.1 گرام / ڪلوگرام جسماني وزن ڪاربوهائيڊريٽ، 1.4 گرام / ڪلوگرام جسماني وزن پروٽين، ۽ 1.6 گرام / ڪلوگرام جسماني وزن چربی) هر تجرباتي ڏينهن کان 48 ڪلاڪ اڳ برقرار رکيو ويو، ۽ تجرباتي ڏينهن جي صبح جو هڪ معياري ناشتو (1.5 گرام / ڪلوگرام جسماني وزن ڪاربوهائيڊريٽ) استعمال ڪيو ويو. مقامي اينسٿيسيا (0.5 ml 1% لائيڊوڪائن بغير ايپينفرين جي) جي تحت، عضلات جي بايوپسي ويسٽس ليٽرالس عضلات مان پرڪيوٽنيئس برگسٽروم اسپيريشن استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي. عضلات جا نمونا فوري طور تي آر اين اي ليٽر ۾ شامل ڪيا ويا ۽ دستي فائبر ڊسڪشن (3 ڏينهن تائين) تائين 4°C تي محفوظ ڪيا ويا.
تازي طور تي الڳ ٿيل مائو فائبر بنڊلن کي ڪلچر ڊش ۾ تازي آر اين اي ليٽر ميڊيم ۾ منتقل ڪيو ويو. انفرادي مائو فائبر کي پوءِ دستي طور تي اسٽيريومائڪرو اسڪوپ ۽ نفيس ٽوئيزر استعمال ڪندي ڪٽيو ويو. هر بايوپسي مان پنجويهه فائبر ڪٽيا ويا، بايوپسي جي مختلف علائقن مان فائبر چونڊڻ تي خاص ڌيان ڏنو ويو. ڪٽڻ کان پوءِ، هر فائبر کي نرميءَ سان 3 μl ليسس بفر (سنگل شاٽ سيل لائسس ڪٽ، بايو ريڊ) ۾ پروٽينيز ڪي ۽ ڊي اين اي اينزائمز تي مشتمل هو ته جيئن ناپسنديده پروٽين ۽ ڊي اين اي کي هٽايو وڃي. سيل ليسس ۽ پروٽين/ڊي اين اي هٽائڻ کي پوءِ مختصر وورٽيڪسنگ ذريعي شروع ڪيو ويو، مائڪرو سينٽريفيوج ۾ مائع کي گھمايو ويو، ۽ ڪمري جي حرارت (10 منٽ) تي انڪيوبيشن ڪيو ويو. پوءِ لائسيٽ کي ٿرمل سائيڪلر (T100، بايو ريڊ) ۾ 37°C تي 5 منٽن لاءِ، 75°C تي 5 منٽن لاءِ، ۽ پوءِ فوري طور تي -80°C تي وڌيڪ پروسيسنگ تائين محفوظ ڪيو ويو.
ايلومينا سان مطابقت رکندڙ پولي ايڊينيلٽيڊ آر اين اي لائبريريون 2 µl مائيفائبر لائسيٽ مان تيار ڪيون ويون هيون، جيڪو ڪوانٽ سيڪ-پول 3′ ايم آر اين اي-سيڪ لائبريري پريپ ڪٽ (ليڪسوجن) استعمال ڪندي ٺاهيو ويو هو. تفصيلي طريقا ٺاهيندڙ جي دستور ۾ ملي سگهن ٿا. اهو عمل ريورس ٽرانسڪرپشن ذريعي پهرين-اسٽرينڊ سي ڊي اين اي سنٿيسس سان شروع ٿئي ٿو، جنهن دوران منفرد ماليڪيولر سڃاڻپ ڪندڙ (UMIs) ۽ نموني-مخصوص i1 بارڪوڊ متعارف ڪرايا ويندا آهن ته جيئن نمونن جي پولنگ کي يقيني بڻائي سگهجي ۽ ڊائون اسٽريم پروسيسنگ دوران ٽيڪنيڪل تبديلي کي گهٽايو وڃي. 96 مائيفائبرز مان سي ڊي اين اي کي پوءِ مقناطيسي موتي سان گڏ ڪيو ويندو آهي ۽ صاف ڪيو ويندو آهي، جنهن کان پوءِ آر اين اي کي هٽايو ويندو آهي ۽ بي ترتيب پرائمر استعمال ڪندي سيڪنڊ-اسٽرينڊ سنٿيسس ڪيو ويندو آهي. لائبريري کي مقناطيسي موتي سان صاف ڪيو ويندو آهي، پول-مخصوص i5/i7 ٽيگ شامل ڪيا ويندا آهن، ۽ پي سي آر کي وڌايو ويندو آهي. هڪ آخري صفائي جو قدم ايلومينا سان مطابقت رکندڙ لائبريريون پيدا ڪري ٿو. هر لائبريري پول جي معيار جو جائزو هاءِ سينسٽيويٽي سمال فريگمينٽ ڊي اين اي اينالائسز ڪٽ (ايجيلنٽ ٽيڪنالاجيز، ڊي اين ايف-477-0500) استعمال ڪندي ڪيو ويو.
ڪيوبٽ ڪوانٽيفڪيشن جي بنياد تي، پولز کي برابر ڪنسنٽريشن (2 nM) تي وڌيڪ گڏ ڪيو ويو. نتيجي ۾ پول کي پوءِ نووا سيڪ 6000 اوزار تي معياري موڊ ۾ نووا سيڪ S2 ريجنٽ ڪٽ (1 × 100 نيوڪليوٽائڊس) استعمال ڪندي 2 nM لوڊنگ (4٪ PhiX) سان ترتيب ڏنو ويو.
اسان جي پائپ لائن ليڪسوجن جي ڪوانٽ سيڪ پول ڊيٽا اينالائسز پائپ لائن (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) تي ٻڌل آهي. ڊيٽا کي پهريون ڀيرو i7/i5 انڊيڪس جي بنياد تي bcl2fastq2 (v2.20.0) سان ڊي ملٽي پلڪس ڪيو ويو. پوءِ ريڊ 2 کي آئي 1 نموني بارڪوڊ جي بنياد تي آئيڊيمڪس (v0.1.6) سان ڊي ملٽي پلڪس ڪيو ويو ۽ يو ايم آءِ سيڪوئنس کي umi_tools (v1.0.1) سان ڪڍيو ويو. پوءِ ريڊز کي ڪٽ ايڊاپٽ (v3.4) سان ڪيترن ئي رائونڊ ۾ ٽرم ڪيو ويو ته جيئن مختصر ريڊز (<20 ڊگھائي ۾) يا ريڊز کي صرف اڊاپٽر سيڪوئنس تي مشتمل ريڊز کي هٽايو وڃي. ريڊز کي پوءِ STAR (v2.6.0c) استعمال ڪندي انساني جينوم سان ترتيب ڏنو ويو ۽ BAM فائلن کي SAMtools (v1.11) سان انڊيڪس ڪيو ويو. ڊپليڪيٽ ريڊز کي umi_tools (v1.0.1) استعمال ڪندي هٽايو ويو. آخرڪار، الائنمينٽ ڳڻپ سب ريڊ (v2.0.3) ۾ فيچر ڪائونٽس استعمال ڪندي ڪئي وئي. پائپ لائن جي ڪيترن ئي وچولي مرحلن تي فاسٽ ڪيو سي (v0.11.9) استعمال ڪندي معيار جو ڪنٽرول ڪيو ويو.
سڀ وڌيڪ بايو انفارميٽڪس پروسيسنگ ۽ ويزوئلائيزيشن R (v4.2.3) ۾ ڪيا ويا، بنيادي طور تي Seurat (v4.4.0) ورڪ فلو استعمال ڪندي. 83 تنهن ڪري، انفرادي UMI قدر ۽ ميٽا ڊيٽا ميٽرڪس کي Seurat شين ۾ تبديل ڪيو ويو. سڀني فائبرن جي 30٪ کان گهٽ ۾ ظاهر ڪيل جين کي هٽايو ويو. گهٽ معيار جا نمونا 1000 UMI قدرن ۽ 1000 دريافت ڪيل جين جي گهٽ ۾ گهٽ حد جي بنياد تي هٽايو ويو. آخرڪار، 925 فائبر سڀني معيار جي ڪنٽرول فلٽرنگ مرحلن کي پاس ڪيو. UMI قدرن کي Seurat SCTransform v2 طريقو استعمال ڪندي معمول بڻايو ويو، 84 سڀني 7418 دريافت ڪيل خاصيتن سميت، ۽ شرڪت ڪندڙن جي وچ ۾ فرق کي واپس ڪڍيو ويو. سڀئي لاڳاپيل ميٽا ڊيٽا ضمني ڊيٽا سيٽ 28 ۾ ڳولي سگهجن ٿا.